Nach den Ereignissen aus dem vorherigen Film wird der Bösewicht Bowser in winziger Größe von Mario und seinem Bruder Luigi gefangen gehalten. Aus seinem Gefängnis heraus singt und schmachtet er jedoch immer noch nach Prinzessin Peach und kann seine Wut nur schwer unter Kontrolle halten. Außerdem ist Bowser Jr., sein manischer Sohn, auf dem Kriegspfad. Er will seinen Vater zurückholen und muss es dabei mit den Klempnerbrüdern aufnehmen. Währenddessen ist auch das gute Leben von Prinzessin Rosalina weiter entfernt bedroht.