Nach den Ereignissen des vorherigen Films wird der Bösewicht Bowser von Mario und seinem Bruder Luigi in winziger Größe gefangen gehalten. Aus seinem Gefängnis heraus singt und schmachtet er jedoch immer noch nach Prinzessin Peach und kann seine Wut nur schwer unter Kontrolle halten. Zudem ist Bowser Jr, sein manischer Sohn, auf dem Kriegspfad. Er will seinen Vater zurückholen und muss es dabei mit den Klempnerbrüdern aufnehmen. Währenddessen ist auch das gute Leben von Prinzessin Rosalina bedroht.